一：用限制性内切酶（每一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并能在特定的切点上切割DNA分子）将植物细胞提供的DNA切成许多片断，通过运载体（通常为质粒，噬菌体，动植物病毒等）将供体细胞提供的DNA转入不同的受体细胞，然后在受体细胞中复制，从中找出含有目的基因的细胞，再将带有目的基因的片断分离出来

二：1，以目的基因转录形成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得需要的基因。 2，通过推测出他的结构基因核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。

植物DNA提取方法

方法一：

1.取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇，继续研磨成略有流动性的糊状或粥状，转入1.5ml的离心管中，于65℃水浴锅中保温约60min。

2.待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI（氯仿：异戊醇=24：1）溶液混匀，轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。

3.重复步骤（2）一次。

4.取步骤（3）上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA 4℃，12000rpm离心10min。

5.弃去上层有机溶剂，加500ul75%乙醇洗涤沉淀，4℃下8000rpm离心5min,弃去上清，洗涤沉淀3次。

6.倒置或者37度培养箱烘干。

7.加50ulTE缓冲液溶解DNA，于-20℃冷藏备用。

方法二：

1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。

2. 植物5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。

3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。

4. 室温下5000rpm离心5分钟。

5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。

6. 在1.5mleppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。

7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。

8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。

9. 加入5μlRNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。

10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。

11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。

12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。

13. 取2μlDNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。

方法三：

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。

4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4·H2O 70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol/LHCl。

10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

正如前述，珍稀濒危植物迁地保护与植物引种驯化有很多是相同或相似之处。就引种、繁殖和栽培技术来说，两者更是大同小异，故可以参考有关专著（谢孝富，1994年，李国庆、刘春慧，1982，盛诚桂，1979年）。只是由于它们均是受人类严重威胁的濒危植物和稀有植物,它们具有一些特殊的生物－生态学特性，在引种、繁殖和栽培它们时，要因种类而异采取一些必要的特殊栽培、繁殖技术。在这里，笔者仅就珍稀、濒危植物迁地保护的方法和为了维持它们的遗传多样性以及使它们能得到安全的迁地保护等必须采取的对策和措施进行讨论。

（一）稀有濒危植物迁地保护的方法

植物迁地保护目前主要是对活的植物体、器官和组织等在人为件下进行保存。随着科学技术的发展，尤其是分子生物学和基因工程的发展，建立基因文库也将是植物迁地保护的一个重要的方法。

1．活植物整体的迁地保护

这种方法也称整个有机体保护法。此法使植物的整个植株脱离其天然的生境，用人工的方法繁殖并栽培在各种条上，如植物园、树木园或其他栽培地，让它们繁后代。由于要维持活的植物，保护物种要有较大的投资，而且在人工条件下很难保证它们不被选择驯化而失去一些遗传基因。

（1）利用植物园、树木园林等对活植物的迁地保护

植物园、树园等地方所建立的标本园、专类区是活植物迁地保护的重要地方。上有不少稀有、濒危植物就是通过这种方法得到保护的。有手足上类已经在它们的自然生境中灭绝了，但在植物园中还保存了它们的少数个体。但由于植物园、树无的土地面积有限、投资有限、难以创造多样化的生境去满足各种植物的需要，其保护的植物种群很小的。所以植物园应以保护地工性的植物区系成分为主，并以此组成一个世界性、地区性或*性的植物园保护网络系统。

（2）其他栽培环境的活植物迁地保护

农、林、园艺等栽培环境也是活植物的重要迁地保护地。古今中外，有不少野生植物就是因为它们具有重要的利用价值，被人们栽培在上环境中，而不断地繁后代如银杏、水杉等，所以有一种说法：“合理利用就是很好的保护”。当然，这些栽培植物在很大程度上被人类驯化改造了。但从植物保护来讲，还是一种很省钱而较有效的辅助方法。

2．种子和组织的迁地保护

保存种子、孢粉、器官和组织等在人工条件下使植物种类及它们的遗传基因能得到延续。为未来的利用、培育计划服务，这是植物迁地保护的另一种方法。这种方法的好处是所占空间小，所需的人力资源少（但一次性的投入较大），而又能较好地保护物种及其遗传的多样性。但它们已脱离了自然环境，对它们的保护及能维持它们从自然采集时所停留的进化阶段。

（1）种子贮藏

这种方法一般适用于可能在干燥、低温条件下贮藏的种子，如禾谷类的玉米、小麦、稻谷，其他如石蒜科植物，胡萝卜、甜菜、番木瓜、辣椒，某些瓜类，黄豆、棉花、向日葵、番茄、菠菜和各种豆类等。而且它们多是一年生或在短时期内可能更新种类。而乔木的种类因更新周期长，热带植物中很多属于顽拗型种子不能在低温、干燥条件下贮藏，而且种寿命很短，一般很难进行种子贮藏。

（2）组织培养

用组织培养的方法保存物种是近年来才发展起来的植物迁地保护新方法之一。这种方法比上述其他方法可能减少空间和维持的费用。一般是在低温（2℃）的条件下，传递至新是的频率可以大大减少，一这种方法可能解决那些不生产种子或虽灰能生产种子，但它们的寿命不低温、干燥条件下贮藏的种类包含了愈伤组织时。而当分生组织培养在液氨进（－196℃）则发现有保存遗传稳定性的潜力（FRANKEL-SOULE,1998年）。

3．基因文库保存法

由于近年为分子生物学和基因工程研究的迅速发展，植物基因转移技术已开始广泛应用，一个分离植物基因如强抗逆性基因、特殊营养价值基因，加上适当的调控元件之后，可以在另一种植物中表达，培育转基因植物以改良其品质和提高作物的逆性性，如抗病害、抗盐碱、抗高温和抗严寒等。这样，一种新的植物迁地保存类型－基因文库（genelibrary）的建设便应运而生了（林忠平，1990年）。当然，它的发展要跨世纪了。

从目前扫展看，基因文库对基因的保存与保护主要有下列式；（1）叶片或其他组织的氮保存；（2）野生植物特殊基因和稀有植物基因（DNA）的提取、分离和保存；（3）其他形式或植物基因材料保存（如标本）等。在基因文库产中，近年来迅速发展的多酶链式反应（polymerase,chainreaction）-PCR技术对DNA扩增起了重要作用。

（二）迁地保护植物遗传多样性的维持

对植物进行迁地保护，人们很关心是能不能保持物种在遗传上的原有稳定性（stability）和变异性（variability）.这是因为它们被监禁起来，中断了它们在自然生态系统中演化过程，而且有执政党小种群而近亲繁殖。此外，保存的植物经若干次更新，尤其采用无性繁殖的方法，不可避免地出现环境的选择作用个小群后些特殊等位基因趋向于固定，发生遗传基因的漂变而很终导致遗传多样性的损失。所以，维持、保存植物的遗传多样性是珍稀、濒危植物迁地保护不同于传统上植物引种驯化的重要之处，必须采取一些相应的措施与对策。

1．多基因库的样品采集法

植物迁地保护时不仅要保存物种，而且要尽可能保存遗传多样性。这样在种子等繁殖植物材料的采集上，除了要选择生长、地正常的母树（植物）采种外，还要应用多基因采样法（multiplegenepoolsampling）即对于该物种繁殖材料的采集不能仅从一两株植物上采，而是要根据其居群的大小，它们是自花授粉还是异花传粉，是雌雄同株还是雌雄异株，以及它们所分布小生境的情况，确定应该采集种子的居群大小，工采用混合采种,以确保所采到的繁殖材料能代表该物种居群所含的遗传我样性。如在美国阿诺德树木园、尽管每种树木公3个单株，也要尽量做到能够包括该种的地理分面范围内不同地点的个体，以保证遗传多样性型和多样性（谢立山，许定发等译，1993年）。而在澳大利亚，他们主张种子采自一个居群中的5－10株植物（meredith,1990年）。

2．迁地保护的有效种群大小

物种保护注重其遗传多样性而要求有一较大的种群，故“多多益善”之说。要维持一个大种群的物种在保护地尚且困难，而在植物园的迁地保护更是不可能。对于保护种群的大小，有研究者（roger,1978年）提出了考虑以下5个因素:

（1）代表性（representation）：所取的样品必须能代表那个居群的遗传多样性。

（2）防止性（preventation）：随着时间推移，不会因选择而出现遗传基因流失；

（3）保存性（preservation）：必须维持物种的遗传完整性；

（4）保持性（retention）：必须能维持居群的基因频率：

（5）资源（resources）：其方法必须具有在人力、空间和设备资源的很小需要。

此外，也提出了一种植物在植物园中保护种群为50－100株植物的建议。对于这个问题，涉及着复杂的因素。因而科学家们正研究物种保护的很小种群（minimumpopulation,MP）或很小存活种群（minimumviablepopulation,MVP）广义的MVP概念有两种：一种是遗传概念，主要考虑近亲繁殖和遗传漂变对种群遗传变异损失和适合下降的影响，即在一定的时间内保持一定时所需的很小离的种群大小；另一种是种群统计学概念，即以一定概率存活一定时所需的很小离的种群大小（ewensetal,1987年；李义明、李典漠，1994年）。很初的研究认为，短期（50年）存活的种群大小不低于50，长期（1000年）。也有根据在干扰生态系统中，有些物种种群降到30－50甚而更少的情况下，它们也还能够自然生存下来，而认为具体情况就是具体分析（Msoule,edi,1986年）。值得一提的是J，N，ELOFF和LWPOWRIE通过对美丽芒荟（aloespectabilis）的三个植株经90年栽培所繁殖的约10000株进行了形态学比较研究，发现他们与300千米以外原植物没基因流动的可能，其特征以有统计学上的显著差异。因而他们认为对一些植物的迁地保护不一定要求太大的种群数（ELOOFpowrei,1990年）。

尽管对MP和MVP的研究已成为保护生物学的一个热点，也取得了较大的进展，但多是涉及动物，而对于植物还没有成熟的方法论和可被广泛接受的准则，也还没有多少可被应用的实例。此，由于不同物种因其繁殖特性、生态学特性，所处的生境环境和受威胁的程度不同，则所要求的MVP不同笔者在1980年根据达尔文（darwin,1996年）、esser(1976年)和ALLARD（1970年）等人的研究，结合自己从事植物地保护的实践和基于植物迁地保护至少要求50－100的的限，提出了一个植物园保护植物种群大小的经验公式（许再富，1990年）：

式中的Pn为应保护的MP；Lf为该物种所属的生活型所要求的保护株数，如乔木种类10－20株，灌木40－50株，而草本100－200株，Ee为经鉴别的生态类型或遗传类型数量；而Am则为该物种的繁殖系统，初步确定为雌雄同株的不论是自花或异花授粉均为1。2，雌雄异株植物为1。0，而无合生殖种类为0。8。这一方法虽然粗糙，但较简单可行，已被国内一些学者所应用。本研究应用此方法，对我国植物园栽培的稀有濒危植物的种群大小（如表6）进行了初步评论（许再富，1997年）。

由于各种稀有、濒危植物要求至少在座个以上的植物迁地保护地（如植物园）保存较为安全，所以这时暂以每一种在一个植物园迁地保存MVP的要求应是10－20，这是假设的保存其遗传多样性的很低标准。由表6可能看出，

表6植物园已保存稀有、濒危植物种群的状况（1994年）

即使是很低标准，在我国植物园对已栽培的*一批保护植物中，仅有25％－38％的物种达到此－很低标准，而且其中有的物种还没有在5个以上的植物园中栽培。而第二批仅有22％－33％达到很低标准。此外，由于我国植物园对于稀有、濒危植物迁地保护的工作开展较迟，很多栽培的植物的年尚小，等到它们能完成从种子到种子的生命周期,还有比较高的死率。所以，为了维持已迁地保护物种的有效种群，要鼓励和支持植物园对稀有、濒危植物的增殖尤其从野外获得的新的种源。在这样的情况下，那些园地面积小的植物园只能保存少数的物种，以保证它们有足免的MVP，而不是保存过多的，均达不到标准的物种。当然，作为科研和建立科普教育的展区则是另外的事了。

1．迁地保护植物的重复栽培

对于一种稀有、濒危植物的迁地保护，从来没有希望只在一个植物栽培，而是要求有较多的复种，这样比较安全。一种植物园栽培，而是要求有较多的复种，然它们旬处在不同片断生态系统一样，会形成异质种群，会使群灭绝概率和近亲繁殖增加，但这也可能减少因种群较大而磁生的病虫害的相互传染，而且今后种群间的个体交流可能对种群存活和遗传多样性保持具有积极的意义。

究竟一种植物要多少个植物园保存才合适，目前还没有可提供答案的资料。多一些总比少些安全，然而，这需更多的投入。根据我国植物园和我国植物受威胁状况，是否可以暂考虑稀有、濒危植物园应在5个以上的植物的保存较为合适，而且它们分布区的自然条件要有一定的差异，以此为标准，我们可以用来评价稀有、濒危植物在我国植物园保存的现状，从表中可以看出，在忆栽培的*一批保护植物中，有利于51。5％的种类在少于5个植物园保存，而第二批则高达95。5％，所以为了提高稀有、濒危植物迁地保护的有效性和安全性，应鼓励和支持些气候条件相似的植物园之间对于那些只有少量植物园栽培的种类的繁殖材料进行交流，或增加自然种群的引种（许再富，1997年）

2.植物繁殖材料的选择

植物繁殖的方法大体上可分为有性方法和无性方法两种，它们对于维持遗传多样性具有不同的杂合度，但通过有性繁殖的后代，它们的杂合度是很高的，保持了其遗传的多样性。所以在植物迁地保护时，对于繁殖材料选择应以种子、孢了为主，强调从种子到种子的过程。

然而，在自然中，有一些植物是或主要通过地下走芭，根茎，鳞茎等进行无性繁殖的方式去繁殖后代的，对于这类植物，民可以采用分株的方法采集迁地保护所需的杰。而在采样的实践中往往遇到一些濒危物种仅能少，在这样的条件下，采集枝条或挖掘小苗也是可行的，但要注意的是，在野外的任何采集均不能竭泽而以免影响处然种群的生存与发展。

（三）植物科学记录系统及其管理

在植物园实行迁地保护的植物主要是以整个生物体进行栽培，并通过世代繁殖而对它们实地较长期的保护。50－100的于保护的目标来说是短暂的，但对植物园来说是相当长的。在此期间，乔木植物可能繁殖了三五代，而灌木和草木植物则要繁10人代以上了，由于植物离开了原来的生境和系统，正如上述，即使在其相同气候区内栽培它们，也可能碰到生态适应性的问题，如土壤基质，小生境，生态位，病虫害，传粉媒介和物种间关系等。这些都可能影响它们的正常生长、繁殖后代及基遗志，基因流失等，这睦都要进行观测，研究分析并记录在案，以利于对其生长发育条件的调控。

随着植物园对稀有、濒危植物迁地保护的进程，物种越来越多，种群越来越大，一个物种的来源多样化而有不同的生态遗传类型，还有S1S2S3如滚雪球一样不断增加，而植物园的研究人员将不断产更替。如不建立一个科学记录系统。使用微机管理，植物园栽培的稀有、濒危植物将成为一笔类涂账。此外，植物园对衡有、濒危植物的迁地保护与它的就地保护是相辅相成的，很终目标是要把它们的人工繁殖体不断放回它们原来的生态系统中去，这称为回归或再引种，再引种在保护生物学的研究中是一个很复杂的科学问题，其难度比引种更甚，如果没有对这些植物在迁地保护的时的生物态特性的观测，研究的详细科学的资料，要帛定再引种的科学方案是不可能的。

植物园迁地保护植物的记录系统中，国际上一些蓍名的植物园已建立了成套的方法(WWF and IUCN-BGCS,1989；Elizabeth,1993),如美国阿诺德树木园在80年代成功地开发了BGBASE,并于1989年出版了《活植物种质资源的收集与保护》一书。在我国，南京植物园对记录系统作了一些研究，已在1990年出版了《植物园记录计算机管理系统》一书，并于1994年又成功研制该园活植物信息和定植图管理系统(LICIS)(顾姻、贺善安主编，1990年；李亚等，1997年）。

据国际植物园保护组织(BGCI,1993)的报告，北美和西欧的大多数植物园的记录都计算机化，南美和非美洲的植物园较少，而亚洲植物园的计算机管理很差（见表8)。对于各个植物园来说，阻碍了植物记录计算机发展的主要原因是不完整的原始数据；而阻碍了世界植物园数据交流的主要是信处项止和项目格式的不统一，大家各自为政，所采用的数据库平台更是千差万别。为了建成植物园栽培植物管理的国际网络，今后的发展趋势将是

（1）植物园的植物管理系统统将步趋于统一；

（2）植物信息管理系统将向多功能方向发展；

（3）信息管理系统将朝着多媒体的方向发展；

（4）植物信息管理系统将逐步走上信息高速公路。

表8植物园计算机设备的世界的分布（BGGI,1993年）

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